飛摩爾級“細胞哨兵”:當智能生物傳感器遇上ChemiDoc MP熒光成像

來源: | 作者:/ | 發布時間: 2025-06-12 | 973 次瀏覽 | 分享到:

智能生物傳感器與合成生物學

新型生物傳感器設計是合成生物學發展的一個重要分支和方向。通過合成生物學技術，生物傳感器的生物識別元件和信號轉換元件可被有效優化，提高靈敏度和特異性。經合成生物學設計的新型生物傳感器可用于：

環境監測：利用合成生物學設計的生物傳感器可以檢測環境中的污染物，如重金屬離子、有機污染物等。這些生物傳感器可以被整合到微生物中，使其在污染環境中生存并發出信號，幫助監測和治理環境污染。
醫療診斷：合成生物學可以設計出能夠檢測疾病標志物的生物傳感器，如檢測血液中的特定蛋白質或核酸。這些生物傳感器可以被整合到便攜式設備中，實現快速、準確的現場診斷。
農業應用：通過合成生物學設計的生物傳感器可以檢測植物病原體或土壤中的營養物質，幫助農民及時采取措施，提高農作物的產量和質量。

其中，細菌監測器已被用于檢測環境中的各種信號，例如：能感應TNT的細菌被用于探測地雷、記憶電路用于記錄糞便樣本中的水平基因轉移、記憶電路用于診斷尿糖等。枯草芽孢桿菌是理想的“哨兵細胞”類型，可以在保持重組DNA完整性的同時存活數年。芽孢可以承受惡劣的條件，包括輻射、剪切應力、高溫、高滲透壓、缺氧條件、真空和氧化應激。

檢測環境DNA的“哨兵細胞”

麻省理工學院的研究團隊利用基因工程改造的芽孢桿菌設計了智能生物傳感器“哨兵細胞”，來監測環境中的DNA序列，特別是人類DNA序列。這種技術有望在法醫學、生態學和流行病學等領域發揮重要作用。他們設計的“哨兵細胞”將DNA攝取能力提高了3000倍，能夠在背景DNA中檢測到飛摩爾級別的目標DNA。

研究者展示了單個細胞或細胞群體能夠同時記錄多個不同的DNA序列。通過構建一個包含多個記錄器的細胞，或者通過構建一個包含多個不同細胞的群體，每個細胞記錄不同的序列，實現了對多個SNPs的同時記錄，并且在細胞內被保護免受核酸酶的降解，即使在惡劣環境下也能保持數周。這一結果發表在權威期刊《Nature Chemical Biology》上（文獻1）。

研究背景

環境DNA監測的重要性：

所有生物都會向環境中釋放DNA，這些DNA可以用于追蹤生物的存在，包括病毒、動物和植物。例如，通過監測環境中的DNA，可以追蹤瀕危物種、識別犯罪現場的嫌疑人或診斷農業病原體。

現有技術的局限性：

傳統的環境DNA檢測方法存在一些挑戰，如需要連續采樣、對非目標序列的干擾敏感、樣本制備復雜、條件敏感、通量低和成本高等。

細菌哨兵的優勢：

細菌哨兵可以作為長期監測環境DNA的工具，因為它們可以在環境中生存并記錄DNA序列。特別是芽孢桿菌（Bacillus subtilis），它能夠形成孢子，具有很強的環境耐受性，并且可以整合外源DNA到其基因組中。

“哨兵細胞”的構建

哨兵細胞基因組包含一個人類序列（藍色），該序列包圍著所需的SNP（黑色）。當人類DNA從環境中獲取時，SNP（A）被記錄在基因組中，并且由于終止子（TT）的切除，基因（gfp）得以表達。五個人類DNA序列，包含與面部形態相關的SNP。

參考SNP等位基因列于括號中。標簽a和b分別表示上游和下游同源臂（SNP本身包含在a中）。超活性枯草芽孢桿菌SCK6的示意圖，以及一組原生基因組編碼基因（虛線框），這些基因由主調控因子ComK的過表達（包括自身調節）激活。

“哨兵細胞”對DNA的攝取

下圖展示了作為“哨兵細胞”的超感受態枯草芽孢桿菌從環境中攝取DNA的原理及實驗結果。

a，人類序列（a和b）被插入基因組。在攝取并整合包含表達盒兩側人類序列的外源DNA后，細胞發出熒光并對卡那霉素產生抗性。

b，數據顯示了SEQ1gfp/kan的攝取和記錄。其他四個序列的攝取情況顯示在擴展數據圖1中。“DNA記錄頻率”為Kanr+GFP+菌落形成單位 (cfu) 數除以菌落形成單位總數。

c，枯草芽孢桿菌S1-S5在木糖存在下對SEQ1gfp/kan-SEQ5gfp/kan的攝取數據。黑線為方程1的擬合曲線。

d，將枯草芽孢桿菌S1與相同的SEQ1gfp/kan質粒或線性產物孵育，比較了環狀或線性DNA的攝取和整合情況。線性靶DNA序列上的同源臂a和b兩側分別連接了取自人類基因組的1kb序列（藍色虛線框）。

“哨兵細胞”的報告基因

研究使用綠色熒光蛋白（GFP）和氯霉素抗性基因（camR）兩種報告基因，分別用于快速熒光檢測并提高靈敏度和特異性。這兩種報告基因的結合使用，使得研究者能夠準確地監測和記錄目標DNA序列在哨兵細胞中的攝取和整合過程。

1.綠色熒光蛋白（GFP）

GFP被用于監測哨兵細胞是否成功攝取并整合了含有特定SNP的目標DNA序列。當目標DNA序列被整合到細胞基因組中后，GFP基因的表達被激活，細胞發出熒光，表明目標DNA序列已被成功記錄。

2.氯霉素抗性基因（camR）

camR基因用于提高檢測的靈敏度和特異性，通過選擇性培養基（含有氯霉素）篩選出成功記錄目標DNA序列的細胞，從而提高了檢測的靈敏度。此外，camR基因的使用也減少了背景突變的干擾，提高了檢測的準確性。

熒光菌落成像及驗證DNA記錄

實驗中，Bacillus subtilis細胞被設計為在成功攝取并整合目標DNA序列后表達GFP。通過檢測GFP的熒光信號，可以確定哪些細胞成功記錄了目標DNA序列。使用ChemiDoc MP成像系統對培養皿進行成像，以觀察和記錄熒光信號。這有助于篩選出成功表達GFP的細胞，從而確認目標DNA序列的攝取和整合。

平板中挑取菌落，并分析終止子的存在。菌落1和2來自-DNA平板（均為GFP陰性），菌落3和4來自+SEQ#平板（但為GFP陰性），菌落5-8來自+SEQ#平板，且為GFP陽性。

ChemiDoc MP全能成像系統

Bio-Rad ChemiDoc MP全能型成像系統具有獨特的五通道熒光，波長覆蓋從藍、綠、紅到近紅外，具備完整的分子成像功能，如核酸凝膠成像、蛋白凝膠成像、Western Blot化學發光成像、WesternBlot多色熒光成像、紅外熒光成像及免染成像，甚至具備切膠功能。ChemiDoc MP系統搭載了創新的CCD芯片及光學定焦鏡頭，保證了成像所必需的靈敏度與分辨率。